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丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量試劑盒說(shuō)明書(shū)

可見(jiàn)分光光度法

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

氧自由基作用于脂質(zhì)的不飽和脂肪酸，生成過(guò)氧化脂質(zhì)；后者逐漸分解為一系列復(fù)雜的化合物，其中包括 MDA。通過(guò)檢測(cè) MDA 的水平即可檢測(cè)脂質(zhì)氧化的水平。

測(cè)定原理：

MDA 與硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)縮合，生成紅色產(chǎn)物，在 532nm有大吸收峰，進(jìn)行比色后可估測(cè)樣品中過(guò)氧化脂質(zhì)的含量；同時(shí)測(cè)定 600nm 下的吸光度，利用 532nm與 600nm 下的吸光度的差值計(jì)算 MDA 的含量。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配置：

提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 30mL×1 瓶，4℃保存；

注意事項(xiàng)：

臨用前注意試劑一是否*溶解，如未溶解，可以 70℃加熱，并振蕩以促進(jìn)溶解。

MDA 提取：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，

加入 1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、吸取 0.6mL試劑一于1.5mL 離心管中，再加入0.2mL 樣本, 混勻。

2、95℃水浴中保溫 30min（蓋緊，防止水分散失），置于冰浴中冷卻，10000g，25℃，離心

10min。

3、吸取上清液于1mL玻璃比色皿中，測(cè)定532nm和600nm處的吸光度，記為A532 和A600，

ΔA= A532-A600。（蒸餾水調(diào)零）

MDA 含量計(jì)算：

1、血清（漿）中 MDA 含量的計(jì)算：

MDA 含量(nmol/mL)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×10⁹]÷V 樣=25.8×ΔA

2、細(xì)菌、細(xì)胞或動(dòng)物組織中 MDA 含量計(jì)算

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

MDA 含量(nmol/mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V樣)=25.8×ΔA ÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

（2）按照樣品質(zhì)量計(jì)算

MDA 含量(nmol/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)

=25.8×ΔA ÷W

(3) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

MDA 含量(nmol/10⁴ )=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)

=0.0516×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，8×10^-4 L；ε：丙二醛摩爾消光系數(shù)，155×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.2 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。

實(shí)驗(yàn)代做服務(wù)：