鵝傳染性漿膜炎核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)
2025-01版
【產(chǎn)品名稱】
商品名稱：鵝傳染性漿膜炎核酸檢測試劑盒（熒光-PCR法）
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預(yù)期用途】
鵝傳染性漿膜炎是由鴨疫里默氏桿菌病(Riemerella anatipestifer)引起的一種接觸性傳染性疾病。本試劑盒適用于檢測鵝呼吸道、消化道或皮膚的傷口等組織樣本或病鵝的血液樣本中的鴨疫里默氏桿菌，用于鴨疫里默氏桿菌感染的輔助診斷。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒采用TaqMan探針法實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)1對(duì)鴨疫里默氏桿菌特異性引物，結(jié)合1條特異性探針，用熒光PCR技術(shù)對(duì)鴨疫里默氏桿菌的核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。
【試劑組成】
名 稱 | 規(guī) 格 |
RA酶液 | 25μL×1管 |
RA反應(yīng)液 | 975uL×1管 |
RA陽性質(zhì)控品 | 50μL ×1管 |
陰性質(zhì)控品 | 50μL ×1管 |
說明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融不超過5次，有效期12個(gè)月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。
【標(biāo)本采集】
病死或撲殺的鵝，無菌剪取呼吸道、消化道或皮膚的傷口樣品1g；生禽取血液樣品，抽取1ml血液進(jìn)行測試
【保存和運(yùn)輸】
上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用2~8℃冰袋運(yùn)輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1 樣本前處理
組織樣品：每份組織分別從3個(gè)不同的位置稱取樣品約1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中；全血樣本：待血凝固后，取血清100μL于1.5mL滅菌離心管中。
1.2 DNA提取
為了使實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、有效、可靠，建議使用商品化的DNA 提取試劑盒進(jìn)行提取，嚴(yán)格按照對(duì)應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行操作。
2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽性對(duì)照；樣品每滿7份，多配制1份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 | RA反應(yīng)液 | 酶液 |
用量（樣本數(shù)為N） | 19.5μL | 0.5μL |
3. 加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟1提取的DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取5μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）
4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi)；
4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為25μL；
熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM檢測鴨疫里默氏桿菌，淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。
4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
步驟 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時(shí)間 | 收集熒光信號(hào) |
1 | 1 cycle | 95℃ | 3min | 否 |
2 | 40 cycles | 95℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5. 結(jié)果分析判定
5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置Baseline和Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及Threshold的Value值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果。
5.2 結(jié)果判斷
陽性：檢測通道Ct值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。
可疑：檢測通道35.0<Ct值<38.0，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線的樣本建議重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)Ct值<38.0且有典型擴(kuò)增曲線者為陽性，否則為陰性。
陰性：樣本檢測結(jié)果無Ct值且無明顯的擴(kuò)增曲線。
6. 檢測方法的局限性
? 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；
? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果；
? 陽性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果；
? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
? 不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
? 試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；
? 本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。
7. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品：無明顯擴(kuò)增曲線且無Ct值顯示；
陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期，且Ct值≤30；
以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無效。
8. 性能指標(biāo)
（1）敏感性：內(nèi)控樣本敏感性為100%，綜合評(píng)價(jià)敏感性98%以上。最低檢測限不低于1000copies/ml。
（2）特異性：100%。
（3）穩(wěn)定性：批內(nèi)及批間差異≤3%。
【注意事項(xiàng)】
? 所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；
? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完全混勻并短暫離心；
? 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；
? 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；
? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；
? 實(shí)驗(yàn)完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；
? 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。
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