土霉素酶聯免疫試劑盒說明書
一、藥物概述及檢測原理
歐盟第675/92號令中初步規定在肌肉及牛奶中的四環素族化合物的總量不得超過100ppb，在腎臟，肝臟及雞蛋中分別不得超過600 ppb，300 ppb及200ppb。
本公司的土霉素酶聯免疫試劑盒使用生物技術開發，具有方便、快速、靈敏等特點。
本試劑盒利用土霉素抗體與土霉素可產生特異性結合的性質，先在酶標板上預包被抗原，再加入標準品（樣本）和土霉素抗體，樣本土霉素藥物與固定在酶標板上的抗原競爭土霉素抗體，最后加入底物催化顯色。此時顯色深度與標準品（樣本）中土霉素藥物的含量成反比。
二、試劑盒內包含組分：
v 10×標準品濃縮液：0 ppb、4ppb、12 ppb、36 ppb、108 ppb，0.5mL/瓶。
v 96孔酶標板：1塊
v 土霉素抗體工作液：1瓶（7mL/瓶）
v 酶標二抗工作液：1瓶（7mL/瓶）
v 20×濃縮洗滌液：1瓶（30 mL/瓶）
v 20×濃縮復溶液：1瓶（10 mL/瓶）
v 底物A液：1瓶（7 mL/瓶）
v 底物B液：1瓶（7 mL/瓶）
v 終止液：1瓶（7mL）
v 說明書
v 蓋板膜
三、用戶需要自備的設備和試劑
儀器：
v 酶標儀（檢測波長450 nm、630 nm）
v 電子天平（精度：0.01 g）
v 離心機（4000 g及以上）
v 生化培養箱（可調25℃、37℃、60℃）
v 旋渦振蕩器
v 微量移液器：（20μl-200μl、100μl-1000μl各一支、30-300ul八道排槍）
v 計時器
試劑：（試劑均為分析純）
v 去離子水
四、試劑盒特異性
試劑盒與其他藥物的交叉反應率：
v 土霉素…………………………100%
v 金霉素…………………………240%
v 四環素…………………………200%
v 強力霉素（多西環素）……………………20%
五、樣本檢測步驟
1. 工作液準備
v 復溶工作液：取1份20×濃縮復溶液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。
v 洗滌工作液：取1份20×濃縮洗滌液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。
v 1 M鹽酸溶液：量取1ml濃鹽酸加去離子水11ml溶解混勻即得。
2. 樣品前處理
組織樣本（稀釋倍數：12）
Ø 準確稱取1±0.01 g均質后的組織樣品于10 mL離心管中；
Ø 加入5 mL去離子水，劇烈渦動2min；
Ø 4000 g以上，離心10 min；
Ø 取500ul上清液加入500ul復溶工作液（見5.1）中，渦動10min；
Ø 取50ul進行檢測。
蜂蜜樣本（稀釋倍數：10）
Ø 精確稱取1±0.01g蜂蜜樣品于10mL離心管中；
Ø 加入2mL去離子水，充分渦動1 min溶解分散；
Ø 取100ul溶解液加入400ul復溶工作液中，渦動1 0S混勻；
Ø 立即取50ul進行檢測。
液態奶樣本方法一（稀釋倍數：10）（同卡那霉素液態奶方法一致）
Ø 將采樣好的液態奶樣本解凍后于室溫靜置平衡30min以上；
Ø 將槍頭伸入原奶樣本下層，小心取出1ml樣本加入2ml離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油）；
Ø 加入50μL 1M鹽酸（見5.1），強烈震搖1min （或使用渦動儀渦動30s）；
Ø 使用離心機室溫4000 g以上離心10 min；
Ø 取上層清亮液體50μL加入另一干凈離心管中（注意：盡量不要取到最上層的奶油），再加入450μL復溶工作液，強烈震搖1min （或使用渦動儀渦動30s）；
Ø 取50 μL液體進行分析。
液態奶樣本方法二（稀釋倍數：40）（同卡那霉素液態奶方法一致）
Ø 精確量取50ul液態奶樣品于1950ul復溶工作液中；
Ø 充分渦動1 min混勻；
Ø 立即取50ul進行檢測。
飼料（牛飼料、豬飼料）（稀釋系數：200 ）
Ø 準確稱取 1±0.01 g 飼料樣品于 50mL 離心管中；
Ø 加入 5 mL 去離子水，充分渦動 2min 至飼料*分散；
Ø 4000 g 以上，離心 10 min；
Ø 取40 μL上清液于新的離心管中，加入1560μL 復溶工作液 ，充分渦動 30 s；
Ø 立即取 50μL 進行檢測。
3. 檢測
Ø 準備：將要使用的酶標板條插入酶標板架上，并記錄各標準品和樣品的位置，為減小檢測值波動建議做雙孔平行實驗（每個樣本/標準品點兩孔），未使用的酶標板條用自封袋密封后，保存于2-8℃環境中以防變質；
Ø 標準品工作液配制：分別取5個2ml離心管，標記為0、0.4、1.2、3.6、10.8ppb；于每個管中加入900ul復溶工作液，于對應管中加入100ul10×標準品濃縮液（0—0、0.4—4、1.2—12、3.6—36、10.8—108）；
Ø 加樣：向對應微孔中加入標準品工作液/樣品溶液50 μL，再向每孔中加入50 μL酶標二抗工作液，再向每孔中加入50 μL抗體工作液；
Ø 孵育：輕輕振蕩酶標板10 s，使孔內液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于25℃避光反應30 min；
Ø 洗滌：取出酶標板后小心揭開蓋板膜，倒出板孔中液體后，在每孔加 250 μL洗滌工作液，浸泡15-30s后倒掉洗滌工作液，然后再加入洗滌工作液重復洗滌3~4次后，將酶標板倒置于吸水紙上，用力拍干；
Ø 顯色：在每孔中加入100 μL 底物A和底物B的混合液（注：底物A液、底物B液必須按體積1:1充分混合，混合液在10 min內使用，切不可使用金屬容器盛裝、攪拌試劑以免底物變質失效）；
Ø 孵育：輕輕振蕩酶標板10 s，使孔內液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于25℃避光反應15 min；
Ø 終止：在反應后的微孔中加入終止液50μL/孔，底物液由藍變黃表明終止成功。
Ø 讀數：終止后的酶標板應在5 min內用酶標儀讀數，建議使用450 nm、630 nm雙波長讀取酶標板吸光度值。
4. 計算結果
Ø 設各標準品（或樣品）的吸光度平均值為B，零標準（濃度為0 ppb的標準品）吸光度平均值B0以(B/B0)×100%為各標準品（或樣品）對應的吸光度的百分比：
Ø 使用半對數系統代入標準品對應的吸光度的百分比，與標準品濃度擬合出標準曲線。
Ø 將待檢樣品吸光度的百分比代入擬合出的標準曲線方程中，即可得出樣品對應的濃度，最后乘以樣品相應的稀釋倍數，即可得出樣品中檢測物含量。
六、試劑盒參數
Ø 試劑盒靈敏度：0.4 ppb；
Ø 標準曲線范圍：0.4 ppb-10.8ppb；
Ø 板內變異系數：<5%；
Ø 板間變異系數：<15%；
Ø B0吸光度最佳值：>0.8；
Ø 回收率：90%±15%
Ø 樣品最低檢測限：
組織……………………………約12ppb
蜂蜜……………………………約20ppb
液態奶樣本方法一……………約20ppb
液態奶樣本方法二……………約40ppb
飼料……………………………約600ppb
注：ppb=ng/mL或ng/g。
七、分析限制
本試劑盒為定量或半定量試劑盒，建議用于大量樣本篩查分析。若檢測結果為陽性，建議使用儀器方法開展確證實驗（如GC/MS、LC-MS/MS等）。
八、試劑盒貯存條件
Ø 試劑盒最佳貯存溫度為2-8℃，切勿凍存。
Ø 未使用完的酶標板須密封保存2-8℃的環境中。
九、注意事項
Ø 使用試劑盒前，請務必仔細閱讀說明書。
Ø 試劑盒使用前，需將盒內各組份置于實驗臺上回溫至室溫（25±2℃）（提示：約1 h）。
Ø 試劑使用前需搖勻，混合時應避免出現氣泡。
Ø 槍頭為一次性用品，為防止試劑交叉污染，檢測過程中所用槍頭不得重復使用。
Ø 請勿使用過期試劑盒，不同批號試劑盒中的試劑不得混用。
Ø 樣品處理完畢后請立即分析，否則可能影響檢測結果。
Ø 底物A液、底物B液均為無色透明液體，若在使用前已變成藍色，或混合后立即變藍，說明試劑已污染或變質。
Ø 加樣過程在保證精度的前提下一定要迅速，以免反應時間差對檢測結果產生影響。
Ø 終止液中含有硫酸，若不小心濺上皮膚或衣物請立即用大量清水沖洗。若不慎入眼，請在*清洗后去醫院檢查。
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