Na+K+- ATP酶活性測定說明書（分光光度法）
貨號：YJ2218
規(guī)格：100管/48樣
產品簡介：
Na+K+- ATP酶廣泛分布于植物、動物、微生物和細胞中，可催化ATP水解生成ADP和無機磷。
Na+K+-ATP酶分解ATP生成ADP及無機磷，通過測定無機磷的量來確定ATP酶活性。
自備的儀器和用品：
可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板跑、研缽、冰和蒸餾水。
產品內容：
提取液：液體100mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入6ml蒸餾水充分混勻待用；用不完的4℃保存一周。
試劑三：液體 2ml×1 瓶，4℃保存。
試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。用時加入3mL蒸餾水4℃保存。
試劑五：粉劑×1 瓶，4℃保存。用時加入25ml蒸餾水，溶解后4℃保存一周。
試劑六：粉劑×1 瓶，4℃保存。用時加入25ml蒸餾水，溶解后4℃保存一周。
試劑七液體25ml×1瓶，室溫保存。
試劑八：10mmol/L 標準磷貯備液 10mL×1 瓶，4℃保存。
0.5μmol/mL 標準磷應用液配制：將試劑八 20倍稀釋，即取 0.1mL試劑八加1.9mL蒸餾水充分混勻。
定磷劑的配制：按H2O:試劑五:試劑六:試劑七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。
注意：配試用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
樣品酶液的制備：
- 細菌、細胞或組織樣品的制備：
細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照每500萬細菌或細胞加入1mL提取液，超聲波破碎細菌或細胞（功率20％，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
組織：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
- 血清（漿）樣品：直接檢測。
操作步驟：
- 分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至660nm，蒸餾水調零。
- 酶促反應（在EP管中加入下列試劑）
| 對照管 | 測定管 |
試劑一（μL） | 65 | 45 |
試劑二（μL） | 60 | 60 |
試劑三（μL） | 40 | 20 |
樣本（μL） | 40 | 100 |
混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）準確水浴10min
試劑四（μL） | 25 | 25 |
樣本（μL） | 100 |
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混勻，8000g，常溫離心10min，取上清液
- 定磷(在EP管或96孔板中依次加入下列試劑)
| 空白管 | 標準管 | A管 | B管 |
0.5μmol/ml標準磷應用液（μL） |
| 20 |
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上清液（μL） |
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| 20 | 20 |
蒸餾水（μL） | 20 |
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定磷試劑（μL） | 200 | 200 | 200 | 200 |
混勻，室溫放置30min，在 660nm處，記錄各管吸光值。
注意：
- 由于每一個樣都必須做對照，本試劑盒100管保證測48份Na+K+-ATP酶。
- 此法具有微量、靈敏、快速的特點。所以對測定所用試管要求嚴格無磷。
- 空白管和標準管只要做一管。
計算：
- 血清（漿）Na+K+- ATPase活力的計算:
定義：規(guī)定每小時每毫升血清（漿）中Na+K+- ATP 酶分解ATP 產生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。
Na+K+-ATP酶活力（U/mL）= （C標準管×V總）×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）÷V樣÷T
=7.5×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）
- 組織、細菌或細胞中Na+K+- ATPase活力的計算：
- 按蛋白濃度計算：
定義：規(guī)定每小時每毫克組織蛋白中Na+K+- ATP 酶分解ATP 產生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。
Na+K+-ATP酶活力(U/mg)= C標準管×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）×V總÷（Cpr×V樣）÷T =7.5×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）÷Cpr
- 按樣本鮮重計算：
定義：規(guī)定每小時每克組織中Na+K+-ATP 酶分解ATP 產生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。
Na+K+-ATP酶活力(U/g)= C標準管×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）×V總÷(V樣÷V樣總×W)÷T=7.5×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）÷W
- 按細菌或細胞密度計算：
定義：規(guī)定每小時每1萬個細菌或細胞中Na+K+-ATP 酶分解ATP 產生1μmol無機磷的量為一個酶活力單位。
Na+K+-ATP酶活力(U/104)= C標準管×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）×V總÷(V樣÷V樣總×500)÷T=0.015×（A測定管-A對照管）÷（A標準管-A空白管）
C標準管：標準管濃度，0.5μmol/mL；V總：酶促反應總體積，0.25mL；V樣：加入樣本體積，0.1mL ；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，1/6小時；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。
